Urease

Ureia amidohidrolases (EC 3.5.1.5), também conhecidas como ureases, são metaloenzimas de alto peso molecular, que contêm níquel e são compostas por várias subunidades.^[2]

Elas são amplamente encontradas em diversas bactérias, plantas, fungos, algas e alguns invertebrados, além de desempenharem um papel essencial no solo como uma enzima do solo.^[3][4]

A urease desempenha uma função catalítica de grande importância, que envolve a hidrólise da ureia, como ilustrado na reação a seguir:

H₂N-CO-NH₂ + H₂O ${\displaystyle {\ce {->[urease]}}}$ H₂N-COOH + NH₃ ${\displaystyle {\ce {->[H2O]}}}$ H₂CO₃ + 2NH₃

Os produtos imediatos dessa reação enzimática são NH₃ e carbamato; entretanto, os produtos observados são NH₃ e H₂CO₃, devido à hidrólise espontânea do carbamato. O aumento na concentração de amônia e o subsequente aumento no pH resultantes da catálise da urease têm implicações médicas e agrícolas.^[5][6]

A ureia, o substrato natural das ureases, foi inicialmente isolada da urina humana por Rouelle em 1773. Cerca de cinquenta anos depois, Wöhler conseguiu sintetizar a ureia, representando a primeira molécula orgânica obtida a partir de compostos inorgânicos.^[7] Em 1864, van Tiehem isolou o primeiro microrganismo ureolítico, o Micrococcus ureae. Em 1874, Musculus isolou a primeira enzima com atividade ureolítica da urina pútrida. Em 1890, Miquel propôs o nome "urease" para essa enzima.^[4] Em 1926, James B. Sumner, ao investigar as sementes de Canavalia ensiformis (feijão-de-porco) com o propósito de elucidar a natureza química das enzimas, isolou cristais de proteínas que exibiam, em suas próprias palavras, "de maneira extraordinária, a capacidade de decompor a ureia em carbonato de amônio". Essa característica, que era idêntica à habilidade já estabelecida da urease, representou o marco inicial na demonstração de que as enzimas eram, de fato, compostas por proteínas.^[8] A descoberta de Sumner lhe valeu o Prêmio Nobel de Química em 1946. Durante as décadas de 1950 a 1970, um período de grande progresso no estudo da estrutura e da bioquímica das enzimas, foram estabelecidos conceitos fundamentais, como a eficiência, a estabilidade e a alta especificidade da urease.^[9] Adicionalmente, em 1975, surgiu o reconhecimento da significativa importância biológica do níquel. Esse reconhecimento ocorreu após minuciosos estudos realizados pelo grupo liderado por Zerner, os quais revelaram a presença de íons de níquel no sítio ativo da urease do feijão-de-porco, destacando a essencialidade desses íons para a atividade catalítica da enzima.^[10] Até então, o níquel era tratado como um metal sem relevância biológica,^[11] mesmo diante das limitações analíticas que, naquela época, impediam uma avaliação precisa deste metal.^[12]

Considera-se que o principal propósito das ureases seja a capacidade de permitir que os organismos aproveitem a uréia, independentemente de sua origem interna ou externa, como uma valiosa fonte de nitrogênio.^[13][14] Além dessa função fundamental, as ureases demonstram notável versatilidade em suas aplicações, podendo desempenhar papéis adicionais, tais como no transporte de nitrogênio, na defesa de plantas e na regulação do ambiente gástrico em mamíferos para possibilitar a colonização bacteriana.^[15] A função das ureases é de grande importância no processo patogênico de várias espécies bacterianas, como Proteus mirabilis, Staphylococcus saprophiticus, Yersinia enterocolitica e Ureaplasma urealiticum.^[16]Contudo, um exemplo frequentemente destacado na literatura é o da urease de Helicobacter pylori, devido à sua ampla prevalência como patógeno em seres humanos e ao papel crucial desempenhado por essa enzima em sua patogênese.^[17] Além disso, a capacidade de produzir urease foi observada em várias espécies de fungos, embora informações genéticas detalhadas estejam disponíveis apenas para um grupo seleto dessas espécies.^[18]Como exemplos, tem-se a Schizosaccharomyces pombe^[19]e patógenos humanos como Coccidioides immitis^[20] e Cryptococcus neoformans.^[21] Quando se trata das ureases encontradas em plantas, as informações genéticas mais abrangentes estão acessíveis principalmente para a soja.^[22]

As informações estruturais sobre a proteína urease provêm de cristais de homólogos das bactérias K. aerogenes^[13], Bacillus pasteurii^[23], H. pylori^[15] e das sementes da planta feijão-de-porco, Canavalia ensiformis^[24]. Em K. aerogenes e B. pasteurii, a estrutura quaternária é composta por um trímero de trímeros (UreABC)₃, com UreA~11 kDa, UreB~12-14 kDa e UreC~60-61 kDa.^[13][23] Por outro lado, no H. pylori, a estrutura quaternária consiste em um tetrâmero de trímeros de dímeros ((UreAB)₃)₄, onde as subunidades menores se fundem em uma única subunidade ~26,5 kDa.^[15] Na urease de feijão-de-porco, as subunidades UreA, UreB e UreC se fundiram para formar uma única subunidade de ~90 kDa. Essa subunidade, por sua vez, se organiza em dímeros de homotriômeros.^[24] Cada subunidade UreA contém dois íons níquel (Ni²⁺), que formam o sítio ativo. Os centros de níquel~3,5-3,7 Å de distância e são ligados por um resíduo carbamato de lisina pós-traducionalmente modificado e um íon hidróxido.^[25] Em estudos de mutagênese direcionada em K. aerogenes, verificou-se que o resíduo de lisina carbamilado não é essencial para a catálise e pode ser substituído por um ácido orgânico não covalente.^[26] Cada um dos átomos de níquel também é coordenado por dois resíduos de histidina e uma molécula de água terminalmente ligada, resultando em um átomo de níquel pentacoordenado em uma geometria piramidal quadrada e um centro de níquel pseudo-octaédrico hexacoordenado que possui um ligante adicional de um resíduo de ácido aspártico (Figura 2). Uma quarta molécula de água é ligada por hidrogênio em proximidade ao cluster dimetálico, formando uma disposição tetraédrica distorcida de quatro moléculas de água/hidroxila que foi sugerida como um intermediário tetraédrico durante o ciclo catalítico.^[25]

O mecanismo de hidrólise da ureia, catalisado pela enzima urease, tem sido amplamente debatido na comunidade científica.^{[27] [28]} Atualmente, parece ter surgido um consenso em relação a esse mecanismo, apoiado por meio de estudos envolvendo inibidores da urease.^{[29][30][31][32]} Após assumir a posição das moléculas de água W1-W3 (Figura 3A) no local ativo da urease, a ureia estabelece uma ligação com o íon Ni(1) por meio do oxigênio carbonílico, tornando o carbono da ureia mais eletrófilo e, assim, mais suscetível a um ataque nucleofílico (Figura 3B). Em seguida, a ureia se liga ao Ni(2) através de um dos seus átomos de nitrogênio amino, estabelecendo uma ligação bidentada com a urease (Figura 3C). Acredita-se que essa ligação facilite o ataque nucleofílico da água ao carbono carbonílico, resultando na formação de um intermediário tetraédrico (Figura 3D), a partir do qual NH₃ e carbamato são liberados (Figura 3E).

No entanto, havia divergências em relação a essa proposição. Enquanto Benini e colaboradores, em 1999^[23], propuseram que o ataque nucleofílico era realizado pela hidroxila de ligação, que fornecia prótons ao grupo NH₃, Karplus e colaboradores em 1997^[9], argumentaram que um resíduo His da aba móvel do sítio ativo atuava como ácido geral nessa protonação. Como alternativa, Karplus e colaboradores, em 1997,^[9] também consideraram a ligação monodentada da ureia ao Ni(1), com Ni(2) fornecendo a molécula de água como nucleófilo para o carbono carbonílico da ureia. Além dessas duas hipóteses, Estiu e Merz, em 2007, com base em modelos computacionais simplificados do sítio ativo, propuseram que a hidrólise e a eliminação poderiam ocorrer de forma competitiva nas ureases, com uma "eliminação assistida por proteína" sendo favorecida.^[33]

As ureases bacterianas desempenham um papel crucial na origem de diversas condições médicas, sendo associadas à encefalopatia hepática, formação de cálculos urinários e desenvolvimento de úlceras pépticas.^[34]

Os cálculos urinários formados por infecção consistem em uma combinação de estruvita (MgNH₄PO₄•6H₂O) e apatita de carbonato [Ca₁₀(PO₄)6•CO₃].Esses íons de carga múltipla são inicialmente solúveis, mas tornam-se insolúveis quando a urease microbiana promove a hidrólise da ureia, resultando na produção de amônia e no aumento do pH do ambiente circundante de cerca de 6,5 para 9. A alcalinização resultante propicia a cristalização das pedras. Em humanos, a urease microbiana predominante associada a pedras urinárias induzidas por infecção é a Proteus mirabilis.^[35]

Estudos indicam que a presença simultânea do Helicobacter pylori e cirrose hepática está associada ao desenvolvimento de encefalopatia hepática e coma hepático.^[36] O Helicobacter pylori libera ureases microbianas no estômago, as quais, por sua vez, hidrolisam a ureia, gerando amônia e ácido carbônico. Como essas bactérias estão localizadas no estômago, a amônia produzida é prontamente absorvida pelo sistema circulatório a partir do lúmen gástrico.^[36] Isso resulta em níveis elevados de amônia no sangue, conhecido como hiperamônia; a eliminação do Helicobacter pylori demonstra reduções significativas nos níveis de amônia.

O Helicobacter pylori é identificado como a causa de úlceras pépticas em 55–68% dos casos relatados.^[37] Essa conclusão foi respaldada pela observação de uma redução no sangramento e na recorrência da úlcera após a erradicação desse patógeno específico.^[37] No estômago, ocorre um aumento no pH da camada mucosa devido à hidrólise da ureia, o que limita o movimento de íons de hidrogênio entre as glândulas gástricas e o lúmen gástrico.^[34] Adicionalmente, as concentrações elevadas de amônia impactam as junções apertadas entre as células, aumentando a permeabilidade e causando perturbações na membrana mucosa gástrica.^[34][38]

O teste rápido de urease, também conhecido como teste CLO (Campylobacter-like organism), é um teste diagnóstico rápido para o diagnóstico de Helicobacter pylori.^[39] A base do teste é a capacidade do H. pylori de secretar a enzima urease, que catalisa a conversão da ureia em amônia e dióxido de carbono. O aumento do pH da urina, resultante dessa reação, é detectado pelo teste.^[40]

Além do H. pylori, outros organismos positivos para urease também podem resultar em um resultado positivo no teste. Esses organismos incluem bactérias, como Proteus, Nocardia, Ureaplasma, Klebsiella, Staphylococcus epidermidis e Staphylococcus saprophyticus e fungos como Cryptococcus, Trichosporon, Malassezia, Coccidioides, Schizosaccharomyces, Emergomyces.^[40][41][42]

A urease é altamente sensível a quantidades mínimas de íons de metais pesados. Foi comprovado que a inibição da urease por esses íons resulta da reação com grupos sulfidrilas no sítio ativo da enzima.^[43] A reação é análoga à formação de sulfetos metálicos. Portanto, os metais que formam os sulfetos mais insolúveis são os inibidores mais fortes da urease. A inibição por Ag⁺ e Hg²⁺ é tão intensa que concentrações na faixa de 10^-6 M podem inativar completamente a urease.^[44] Também foi demonstrado que a inibição da urease por íons de metais pesados (Mn²⁺, Fe³⁺, Co²⁺, Zn²⁺, Cd²⁺, Ni²⁺, Cu²⁺, Ag⁺ e Hg²⁺) é não competitiva.^[43][44]

Muitos compostos, além de substrato, produto e tampões, são inibitórios para a urease. Entre eles estão análogos de ureia, incluindo ureias alquiladas, tioureias, hidroxureia e ácidos hidroxâmicos, fosforoamidas, tióis, ácidos bóricos, ácidos borônicos, fluoreto e reagentes reativos a tióis.^{[45] [12][46]} Inibidores de urease têm potencial valor no controle de infecções humanas no trato urinário e gastrointestinal, além de aumentar a eficiência dos fertilizantes de ureia. ^[45]

A urease, em conjunto com a ureia amidolase, desempenha um papel crucial na degradação de ureia em plantas, facilitando sua assimilação celular. ^[47][48] Em plantas superiores, que possuem sistemas de transporte de ureia, a otimização da nutrição nitrogenada ocorre com base no ambiente externo ou na síntese interna. A presença de ureases no solo permite a absorção de ureia pelas raízes como amônia, prática explorada na fertilização.^[49] No entanto, doses elevadas de ureia podem representar riscos tanto para o ambiente quanto para as plantas.^[50] Além disso, a ureia é aplicada foliarmente, sendo absorvida rapidamente, embora em concentrações elevadas possa ser tóxica. Nas células vegetais, a urease desempenha um papel no metabolismo nitrogenado,^{[50][51] [48]} sendo a ureia um intermediário essencial em processos metabólicos.^[52][53][54] A urease, além de atuar na defesa contra patógenos gerando amônia, também exibe propriedades inseticidas e antifúngicas.^{[55][56][57][58][59]} Encontrada amplamente em plantas, a urease é especialmente abundante em sementes de leguminosas, como soja (0,012% de urease/massa seca) e feijão (0,07–0,14%).^[60][61][62]

A atividade ureolítica nos solos, especialmente proveniente da urease do solo, desempenha um papel crucial na agricultura, convertendo ureia em amônia para utilização eficiente como fertilizante de nitrogênio.^{[63][64][65][66]} No entanto, essa hidrólise rápida pode resultar em perdas improdutivas de nitrogênio por volatilização de amônia, causando impactos adversos no ambiente e nas plantas.^[63][64][65] A volatilização de amônia também é um desafio na gestão de resíduos de animais, reduzindo o valor do esterco líquido como fertilizante.^[67] Além disso, esforços para reciclar a urina visam economizar água, suprimindo a atividade da urease para evitar emissões de amônia.^[67] Em todas essas situações, a possibilidade de controlar a atividade da urease por meio do uso de inibidores enzimáticos é uma consideração importante.

Ureases desempenham um papel crucial na formação de carbonato de cálcio, participando da hidrólise da ureia e promovendo a precipitação de CaCO₃ em diversos ambientes naturais, como solos e águas.^[68][69][70] Esse processo é atribuído a três principais funções bacterianas: aumento da alcalinidade, elevação da concentração de carbono inorgânico dissolvido e atuação como locais de nucleação cristalina.^[69][70] Além de contribuir para a compreensão dos processos de calcificação na natureza, a calcificação biocatalítica biomimética apresenta potencial em diversas aplicações biotecnológicas inovadoras^[71], como a preparação de materiais avançados de carbonato^[72][73][74], limpeza de águas residuais^[75], restauração de monumentos históricos^[76] e uso como agente de obstrução em reservatórios de petróleo.^[77][78] A hipótese de urease relacionada à biomineralização de carbonato de cálcio por invertebrados sugere implicações nas extinções em massa da Terra^[79][80], destacando a influência da pressão parcial de CO₂ atmosférico e do pH da água do mar nesse contexto.

• Helicobacter pylori

Referências